Активные сперматозоиды животных подвергаются замораживанию

Репродуктивная эффективность и генетический прогресс имеют важное значение в животноводстве и являются движущей силой развития. Одним из наиболее ярких достижений является искусственное осеменение сельскохозяйственных животных. Замороженная сперма животных позволяет сохранить генетические свойства различных видов и пород животных.

Нормальные сперматозоиды сельскохозяйственных животных подвергаются замораживанию

Для сохранения спермы животных её замораживают жидким азотом. Для того чтобы нормальные сперматозоиды в замороженном виде сохранили свои свойства необходимо строго соблюдать технологию заморозки семени.

Для этого прежде всего был разработан состав среды, в которой сперматозоиды могли жить не теряя своих функций.

Состав среды выглядит следующим образом:

• Вода бидистиллированная — 100 мл
• Лактоза — 11,5 г
• Желток — 20,0 мл
• Глицерин — 5,0 мл
• Спермосан — 50 тыс. ед.

Подготовка семени к заморозке

Раствор лактозы необходимо прокипятить, глицерин стерилизовать в автоклаве, яйцо обтирается спиртом. Семя замораживается с подвижностью 8 баллов и концентрацией 0,8 млрд. в мл.

Полученное семя разбавляют 1 : 1 в лактозном разбавителе, температура равна 30 градусам разбавителя. Затем семя постепенно охлаждают до температуры +4 градуса и выдерживают 4 часа при этой температуре. Это называется периодом эквилибрации.

В дальнейшем семя набирают в медицинский шприц и накапывают на пластинку из фторопласта по 0,1 мл = 2 капли. Пластину охлаждают в жидком азоте и при температуре — 196 градусов. После замораживания семя ссыпают в стаканчик, помещают в канистру и хранят в сосуде с жидким азотом.

Для размораживания во флакон наливают один мл раствор цитрата натрия. Помещают в водяную баню флакон при температуре 40 градусов и бросают гранулу.

Подвижность размороженного семени должна быть не ниже 3 баллов.

Подвижность семени, баллов

Концентрация млрд/мл

		1,0	1,3	1,6
10		1 : 16	1 : 20	1 : 24
9		1 : 14	1 : 18	1 : 22
8		1 : 12	1 : 16	1 : 20

Холодовой удар

Охлаждение с последующим замораживанием должно проходить без холодового удара.

На первых стадиях понижение температуры, от температуры тела до 0 градусов, должно проходить не более одного градуса в минуту.

Признаки холодового удара:

1. У сперматозоидов закручивается хвост.
2. Происходит потеря липопротеинов и фосфолипидов из оболочек клеток.
3. Происходит выход ферментов, обеспечивающих оплодотворяющую способность (гиалуронидаза, акрозин, фосфотозы, из митохондрий выходят атефаза, дегидрогеназа).

Стадия замерзания

Замораживание возможно в присутствии веществ берущих на себя свободную воду — криопротекторы (глицерин).

В семени содержится 90 % воды. Замерзание начинается с образования центров кристаллизации. В центрах образуются скопления с минимальной подвижностью. Там образуется гипертоническая среда из солей и сахаров и центры берут на себя остальную свободную воду. Идет процесс обезвоживания клеток — этому способствует глицерин.

Самая трудная зона температур от — 30 до — 50 градусов. При медленном охлаждении в семени начинают образовываться крупные кристаллы, которые губительны (разрывают) для структуры клетки.

При быстром прохождении этой зоны кристаллы образуются очень мелкими или совсем не образуются. Тогда идет процесс стекловидного замерзания — витрификация.

Весь процесс замораживания семени в гранулах составляет с нескольких секунд до нескольких минут. Клетки замерзают в виде маленьких крупинок.

Если семя замораживается в пайетах часть холода идет на пайету. Замораживание объемом 0,5 мл в пайетах занимает 7 минут, а в гранулах — меньше.

Где сперматозоиды хранятся: замораживание в гранулах

Семя помещается в лактозо-желточно-глицериновой разбавитель.

Состав среды включает в себя:

1. Дистиллированная вода — 100 мл
2. Лактоза — 11,5 г
3. Желток — 20 мл
4. глицерин — 5 мл
5. Спермосан — 50 тыс. ед.

Разбавление семени делается 1 : 1. После разбавления семя охлаждается до температуры + 4 градуса в течении одного — двух часов. Затем 3 — 4 часа выдерживается для проникновения веществ в клетки из разбавителя.

Уравновешивание веществ между клеткой и разбавителем, называется эквилибрацией.

Охлажденное семя до + 4 градусов набирается в шприц и накапливается в лунке охлажденной второпластовой пластины (- 130 — 140 градусов). В лунку капается 1 — 2 капли, чтобы получить гранулу. Гранулы ссыпаются в металлический стаканчик ставятся в канистры и помещаются в жидкий азот.

Через сутки проверяется подвижность замороженного семени (активность не менее 4 баллов).

Размораживание происходит в пенициллиновом флаконе 1 мл 2,9 % раствора цитрата натрия и с температурой + 40 градусов. Первый месяц семя стоит в карантине хранилища, если все хорошо переносится в стационарное хранилище на года.

Замораживание семени в пайетах

Пайеты бывают двух видов — 0,25 и 0,54 мл.

Семя разбавляется двух-моментно:

• Температура среды I +32 +34 градусов + семя охлаждается до температуры + 5 градусов в течении 40 — 50 минут.
• При температуре + 5 градусов + среда II, семя разбавляют 10 — 26 раз. Мецифос = среда I + среда II. Семя оставляем при температуре + 5 градусов в течение 3 — 4 часов.
• Далее идет машинная расфасовка под вакуумом в пайеты и запайка ультразвуком.

Для замораживания пайеты помещают в горизонтальное положение в штативы и помещаются в широкогорлый сосуд. Температура сосуда контролируется термопарой — 140 — 150 градусов.

В парах азота пайеты выдерживаются 7 — 8 минут, потом они ставятся вертикально и помещаются в карантинное хранилище. Через сутки проверяются на активность. Оттаивание в водяной бане в течение 15 секунд, температура +34 градуса. Отрезается пробка и берется семя для анализа.

Осеменение с помощью пайет осуществляется специальным пистолетом с чехлом. Одна пробка отрезана, другая служит поршнем для выталкивания семени из пайеты.

Достоинство пайеты — это защищенность семени от грязи.

Сперма баранов и её замораживание

Сперма баранов имеет много рыхло-связанных липо-протеинов. Для замораживания используются добавки в составе разбавителя, который предохраняет от окисления и разрушения вещества оболочки (противоокислители витамин Е).

Состав среды выглядит следующим образом:

1. Сахароза
2. Глюкоза
3. Хелатон
4. Витамин Е (2 мл на 100 мл среды)
5. Глицерин
6. Спермосан — 3

Сперма баранов плохо замораживается. Благоприятствует замораживанию обработка семени в атмосфере водорода.

Сперма хряка и её замораживание

Сперма хряка замораживается очень плохо из — за большого объема и рыхлых комплексов в мембране. Семя частично концентрируется — отбрасывается часть семенной плазмы после центрифугирования, обрабатывается водородом.

Подписывайтесь на наши социальные сети: